Total Nitric Oxide Colorimetric Assay Kit

总一氧化氮检测试剂盒（显色法）

产品标签

Nitric Oxide (NO)一氧化氮；NO含量检测；分光光度计检测；Griess reagent；Carboxy-PTIO一氧化氮清除剂；DAF-FM DA； 

产品信息

产品名称	产品编号	规格	价格（元）
Total Nitric Oxide Colorimetric Assay Kit 总一氧化氮检测试剂盒（显色法）	JP4732-50T	50T	969
	JP4732-200T	200T	2989

产品描述

一氧化氮（Nitric Oxide, NO）是一种活性基，在许多关键生理功能中发挥重要作用。一氧化氮，一氧化氮合酶（NOS）催化精氨酸的氧化产物，参与宿主防御和发育、调节蛋白活化、以及与功能生物分子之间的直接共价相互作用。一氧化氮生成后迅速代谢生成亚硝酸盐（Nitrite）和硝酸盐（Nitrate），两种首要的、稳定的和非挥发性的裂解产物，通过对这两种产物的测定能间接反映样本内的一氧化氮水平。

本总一氧化氮检测试剂盒（Total Nitric Oxide Colorimetric Assay Kit）利用两步法测定总一氧化氮水平，第一步先用硝酸盐还原酶（Nitrate reductase）将硝酸盐还原为亚硝酸盐，第二步再用经典的Griess reagent，对亚硝酸盐进行定量测定，从而推算出总一氧化氮含量。

由于本试剂盒使用的是NADPH依赖的硝酸盐还原酶，高浓度的NADPH会干扰后续检测，因此，试剂盒使用乳酸脱氢酶（LDH）来清除NADPH，确保检测结果的准确性。

本试剂盒以亚硝酸钠为标准品，通过优化的检测体系，检测下限达2μM，且在2~80μM范围内具有良好的线性关系。本试剂盒不仅能检测细胞、组织或培养液中的一氧化氮含量，还能检测血清、血浆或尿液中的一氧化氮含量。

产品组成

组分编号	组分名称	保存	货号（规格）
			JP4732-50T	JP4732-200T
JP4732-A	Sample Diluent 样品稀释液	-20℃	15ml	15ml
JP4732-B	NADPH	-20℃避光	5mg	5mg
JP4732-C	FAD	-20℃	550μl	2.2ml
JP4732-D	Nitrate Reductase硝酸盐还原酶	-20℃避光	250μl	1ml
JP4732-E	LDH Buffer LDH缓冲液	-20℃	550μl	2.2ml
JP4732-F	LDH	-20℃	500μl	2ml
JP4732-G	NaNO2 (1M)	-20℃避光	1ml	1ml
JP4732-H	Griess Reagent I	-20℃避光	3ml	12ml
JP4732-I	Griess Reagent II	-20℃避光	3ml	12ml

保存与运输方法

保存：-20℃保存，一年稳定。

运输：冰袋运输。

注意事项

1） 当检测细胞或组织一氧化氮含量，不建议使用RIPA裂解液，因其可能在后续实验中产生沉淀，影响测试。建议使用一氧化氮分析用裂解液（不含蛋白酶/磷酸酶抑制剂）（货号：MP1509-100ML）。也可自行选择适当方式制备组织或细胞样品的裂解液，要考虑到自行选择的方式是否存在干扰试剂盒内酶反应的可能。

2） 当检测细胞培养液内一氧化氮含量，不可使用RPMI1640等含较高浓度硝酸盐的培养液，否则会干扰检测。

3） 所有检测反应需避光进行。

4） 由于检测过程存在还原反应，凡是影响还原反应的试剂都需要避免，比如DTT或2-ME。

5） 本试剂盒利用的是间接法测定总一氧化氮含量，如果只需粗略测定一氧化氮相对量，可选择我司提供的一氧化氮检测试剂盒（货号：JP4731-500T）。如果需要直接测定一氧化氮水平，比如测定细胞内实际的一氧化氮水平，可选择我司提供的DAF-FM DA一氧化氮荧光探针（货号：JP4702-100T）。

6） 本试剂盒对人体有害，请注意适当防护，避免直接接触人体或吸入体内。

7） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

操作步骤

【注意】本试剂盒可用于培养液中的一氧化氮测定，培养液内的酚红和10%血清对测定无明显干扰。

【注意】样品中存在的一些内在成分可能会干扰测定，导致OD值和灵敏度降低。干扰程度依次顺序：尿液>血清>血浆>培养基。

一、 需要设备

96孔酶标仪，最佳波长540nm，或在520~560nm下测定，灵敏度可能会降低。

二、 准备步骤

2.1 标准品准备：

每次测量均新做标准曲线，用待测样品所用溶液来稀释标准品，使得浓度在2~80μM内。标准品的浓度通常可取2，5，10，20，40，60，80μM。

比如：当样品为细胞培养液上清，细胞培养液为DMEM+10% FBS，则用DMEM+10% FBS稀释标准品；当样品为血清，可使用本试剂盒内提供的样品稀释液（JP4732-A），或简单使用PBS、生理盐水等适当溶液稀释标准品；当样品是用一氧化氮分析用裂解液得到的裂解液，则用此裂解液稀释标准品。

2.2 样品准备：

a）对于含高浓度蛋白的样品如血清，或含高浓度血清的细胞培养液，加入Griess reagent I后可能产生沉淀，可取50μl样品，加入50μl Griess reagent I进行测试，观察是否产生沉淀。如有沉淀，则把样品沸水浴加热5min以变性蛋白，之后12,000离心5min，取上清用于后续的测定。

b）当样品为组织或细胞，可快速冻融裂解，然后离心沉淀取上清，体积不足50μl，可用双蒸水、超纯水或0.9% NaCl稀释（相应的标准品也需用双蒸水、超纯水或0.9% NaCl稀释）。细胞或组织也可用一氧化氮分析用裂解液来裂解，同样的，标准品需用此裂解液稀释。

c）当样品为尿液，通常需用水稀释10~50倍后检测。

d）当样品为血浆，不宜用肝素抗凝的血浆，因其会和Griess reagent反应产生沉淀。

2.3 试剂准备

a）加1ml双蒸水或超纯水至5mg NADPH中，颠倒混匀使其充分溶解，之后再加3ml双蒸水或超纯水定容至3ml，配制成2mM NADPH，多余部分按照单次用量分装，立即置于-70℃保存。

b）FAD第一次使用可适当分装后放在-20℃或-70℃保存。

c）硝酸还原酶和LDH临用前取出，放置在冰浴上使用，使用完毕后需立即放回-20℃保存。

d）试剂盒内的其余各种试剂溶解后保存在冰浴上。

e）Griess reagent I和Griess reagent II使用前需回温至室温。

三、测定步骤

3.1参考下表依次加入标准品、样品和检测试剂，并进行相应检测：

	空白对照	标准品	待测样品
标准品	/	60μl	/
待测样品	/	/	Xμl
用于样品稀释的溶液	60μl		(60-X) μl
2mM NADPH	5μl	5μl	5μl
FAD	10μl	10μl	10μl
硝酸盐还原酶	5μl	5μl	5μl
	混匀后，37℃孵育30min
LDH Buffer	10μl	10μl	10μl
LDH	10μl	10μl	10μl
	混匀后，37℃孵育30min
Griess Reagent I	50μl	50μl	50μl
Griess Reagent II	50μl	50μl	50μl
	混匀后，室温（20~30℃）孵育10min后测定A540

【注意事项】

a） 反应必须避光进行。当使用96孔板进行检测，可用铝箔纸包裹96孔板进行避光。

b） 样品的用量上限为60μl。血清、血浆或组织匀浆液通常使用40μl足够。样品不足60μl，不同样品之间的体积需要保持一致，体积不足的部分用制备或稀释样品所用的溶液补足。

c） 可同时设置加入200μl水或PBS的2~3个孔为阴性对照，这2~3个孔仅加入水或PBS，不在加入任何其他试剂。

d） 加入Griess reagent I后需轻轻混匀。

e） 每次混匀后，可以1000~3000g离心数秒，把液体沉淀至管底。同时需避免各检测孔中产生气泡，以免气泡干扰检测结果。

3.2 在540nm（或520~560nm）测定吸光度。需在30min内测完，以防褪色降低灵敏度。

3.3 以标准品浓度为横坐标，吸光度OD值为纵坐标绘制标准曲线，获得横纵坐标之间的函数关系式。之后将样品OD值代入公式来计总算一氧化氮浓度。

3.4 标准曲线示例见右图，仅供参考。实际测定时，由于反应条件、试剂盒批次差异等因素，会导致检测结果与示例数据存在一定差异。