Cell Counting Kit (CCK-8) CCK-8细胞增殖及毒性检测试剂
货号: JP3008-50ML 品牌: Jinpan 标签: 细胞生物学研究
描述
Cell Counting Kit (CCK-8) CCK-8细胞增殖及毒性检测试剂
产品标签
CCK-8细胞增殖及毒性检测;WST-8;MTT 噻唑兰;Alamar Blue 阿尔玛蓝;XTT;WST-1;
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产品名称 | 产品编号 | 规格 | 价格(元) | 促销价(元) |
Cell Counting Kit (CCK-8) 细胞增殖及毒性检测试剂 | JP3008-1ML | 1ml (100T) | 125 | 105 |
Cell Counting Kit (CCK-8) 细胞增殖及毒性检测试剂 | JP3008-5ML | 5ml (500T) | 500 | 425 |
Cell Counting Kit (CCK-8) 细胞增殖及毒性检测试剂 | JP3008-10ML | 10ml (1000T) | 900 | 765 |
Cell Counting Kit (CCK-8) 细胞增殖及毒性检测试剂 | JP3008-50ML | 50ml (5×1000T) | 4100 | 3275 |
Cell Counting Kit (CCK-8) 细胞增殖及毒性检测试剂 | JP3008-100ML | 100ml (10×1000T) | 6480 | 5175 |
质量控制:
产品描述
Cell Counting Kit (CCK-8),中文名CCK-8细胞增殖及毒性检测试剂,简称CCK-8试剂盒,是一种基于WST-8(化学名为2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)的一种广泛应用于细胞增殖和毒性检测的快速高灵敏度试剂盒。
WST-8是MTT(噻唑兰)的升级产品,检测原理(见下图)为:在电子耦合试剂存在的情况下,WST-8可被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物(formazan)。颜色的深浅与活细胞数量(细胞增殖)成正比,与细胞毒性成反比。通过酶标仪在450nm波长处测定OD值来反映细胞增殖,以及细胞毒性水平。
CCK-8法应用非常广泛,包括药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等。
保存与运输方法
保存:2-8℃避光保存,一年有效。-20℃避光保存,二年有效。
运输:冰袋运输。
注意事项
1) 第一次做实验时,建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间。
2) 接种时注意细胞悬液一定要混匀,以避免细胞沉淀下来导致每孔中的细胞数量不等,可以每接种几个孔就混匀一下。培养板周围一圈孔培养基容易挥发,为减少误差,建议培养板的四边每孔只加培养基,而不作为指标检测孔。
3) 培养时间根据细胞种类不同和每孔内细胞数量的多少而异。一般情况白细胞较难显色,因此需要较长的CCK-8反应时间或增大细胞数量(~105个细胞/孔)。悬浮细胞比贴壁细胞较难显色,对于悬浮细胞,加入CCK-8培养1-4小时后,可先从培养箱中取出,目测染色程度或用酶标仪测定来决定。若显色困难,可将培养板放回培养箱,继续培养数小时后再确定。对于贴壁细胞,CCK-8的培养时间一般为1-4小时,但培养30分钟左右可取出肉眼观察显色程度(根据细胞类型而定,需要摸索一定条件)。注意:CCK-8的最佳反应时间以实际显色的最佳时间为准。
4) 有条件的情况下建议采用多通道移液器,可以减少平行孔间的差异。加入CCK-8试剂时,建议斜贴着培养板壁加,不要插到培养基液面下加,容易产生气泡,会干扰OD值读数。
5) 加CCK-8速度要快,减少试剂在移液器上的残留。为使CCK-8试剂和培养基充分混匀,建议在加入CCK-8后轻轻震摇培养板。为了避免加样时由于CCK-8在枪头上残留所引入的误差,可以在加样前用培养基稀释CCK-8并混匀后加样。
6) CCK-8的核心成分WST-8会与还原剂反应生成WST-8甲臢,若实验体系内含有还原剂,请务必检测背景OD值(即在不含细胞的培养基中加入药物,然后加入CCK-8在一定时间内检测)和不加药物的培养基(只加CCK-8)进行比较。如果OD值明显偏高,则说明的确存在反应。
7) 若细胞培养时间较长,培养基颜色发生变化或pH发生变化,建议更换新鲜的培养基后再加入CCK-8。含酚红的培养基不影响CCK-8测定细胞活性。
8) 如果样品为高浑浊的细胞悬液,建议设定600nm(或600nm以上)作为参比波长,扣除参比波长的OD值即可。
9) CCK-8对细胞毒性非常低,其与活细胞脱氢酶持续反应使溶液颜色不断加深,OD值不断增加(由于脱氢酶是持续产生的)。另外,其他实验比如中兴红法或结晶紫法,也可在CCK-8检测完成后继续进行。
10)若需要测定细胞的具体数量,建议先做一个标准曲线。
11)如果没有450nm的滤光片,可以使用吸光度在430-490 nm之间的滤光片,但是450nm滤光片的检测灵敏度最高。
12)关于CCK-8的更多问题,请见附录I. CCK-8使用常见问题集锦。
13)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用方法
1. 制作标准曲线(测定细胞具体数量)
1) 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量,然后接种细胞到培养板内。
2) 按比例(例如:1/2比例)依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度,一般要做3-5个细胞浓度梯度,每个浓度建议3-6个复孔。
3) 接种后培养2-4小时使细胞贴壁,然后加CCK-8试剂培养一定时间后测定OD值,制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴),OD值为纵坐标(Y轴)的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量(使用此标准曲线的前提是实验的条件要一致,便于确定细胞的接种数量以及加入CCK-8后的培养时间。)
2. 细胞活性检测
1) 在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔)。将培养板放在培养箱中预培养一段时间(37℃,5% CO2)。
2) 向每孔加入10 μL CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数)。
3) 将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
4) 用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
5) 若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10 μL0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定,吸光度不会发生变化。
3. 细胞增殖-毒性检测
1) 在96孔板中配制100μL的细胞悬液。将培养板放在培养箱预培养24小时(37℃,5% CO2)。
2) 向培养板加入10μL不同浓度的待测物质。
3) 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(例如:6、12、24或48小时)。
4) 向每孔加入10μL CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数)。
5) 将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
6) 用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
7) 若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10 μL0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定,吸光度不会发生变化。
【注意】:如果待测物质有氧化性或还原性的话,可在加CCK-8之前更换新鲜培养基(除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次,然后加入新的培养基),去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下,可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
活力计算
细胞活力*(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)] ×100
A(加药):实验孔(含有细胞的培养基、CCK-8溶液和药物)的吸光度
A(空白):空白孔(不含细胞和药物的培养基,含CCK-8溶液)的吸光度
A(0加药):对照孔(含有细胞的培养基、CCK-8溶液,不含药物)的吸光度
*细胞活力:细胞增殖活力或细胞毒性
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附录I. CCK-8使用常见问题集锦
1) CCK-8与其他细胞增殖-毒性检测方法的优势在哪里?
检测方法
特征比较 |
MTT法 | XTT法 | WST-1法 | CCK-8法 |
甲臢产物的水溶性 | 差,需有机溶剂溶解后再检测 | 好 | 好 | 好 |
产品性状 | 粉末 | 2瓶溶液 | 单瓶溶液(或粉末+溶液) | 单瓶溶液 |
使用方法 | 配成溶液后使用 | 现配现用 | 即开即用(或现配现用) | 即开即用 |
检测灵敏度 | 高 | 很高 | 很高 | 非常高 |
检测时间 | 较长 | 较短 | 较短 | 最短 |
检测波长 | 560-600nm | 420-480nm | 420-480nm | 430-490nm |
细胞毒性 | 高,细胞形态完全消失 | 很低,细胞形态不变 | 很低,细胞形态不变 | 很低,细胞形态不变 |
试剂稳定性 | 一般 | 较差 | 一般 | 很好 |
批量样品检测 | 可以 | 非常适合 | 非常适合 | 非常适合 |
便捷程度 | 一般 | 便捷 | 便捷 | 非常便捷 |
2) 单孔接种多少个细胞?
当使用96孔板时,贴壁细胞的最小接种量至少为1000个/孔(100μL培养基)。检测白细胞的灵敏度相对较低,因此建议接种量不低于2500个/孔(100μL培养基),建议先做几个孔摸索接种细胞的数量。若使用24孔板或6孔板,请先计算每孔相应的接种量,然后按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8。
3) 如何设定空白对照?
在不含细胞的培养基中加入CCK-8,测定450nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时,还应考虑药物的吸收,可以在不含细胞、加入药物的培养基中加入CCK-8,测定450nm的吸光度作为空白对照。
4) 哪些物质会影响CCK-8的测定?
当有还原性物质存在时会增加CCK-8的测定,增加OD值;当有氧化性物质存在时会抑制测定反应的发生,降低OD值。在有酚红存在的情况下,会增加空白吸收,但不影响测定,扣除空白吸收即可。
5) 做加药实验时,药物对测定是否有影响?如何解决?
有时会有影响。如果药物具有还原性就会和CCK-8发生显色反应,增加OD值。解决方法:首先要确认药物是否有吸收,在含有药物的培养基中加入CCK-8,测定450nm的吸光度。如果它的吸光度比不含药物的培养基(只加CCK-8)的吸光度高,则说明药物有影响,可在加CCK-8之前更换培养基,去掉药物的影响。
6) CCK-8对细胞的毒性大小如何?
CCK-8对细胞毒性相当低,同样的细胞在CCK-8检测后还可用于其他细胞增殖的检测实验,比如结晶紫检测法,中性红检测法或DNA荧光检测法等。由于每种细胞对CCK-8的耐受力不同,因此若需要长时间孵育,先检测下细胞在加入CCK-8后的活力。
7) 如果没有450nm的滤光片,还可以使用哪些其他滤光片?
还可使用430-490nm之间的滤光片,但450nm滤光片的检测灵敏度最高。
8) CCK-8能否对活细胞进行染色?
不能。因为CCK-8的主要成分是一种水溶性四唑盐(WST-8),并通过电子载体1-methoxy PM将活细胞中的电子交换到培养基中的WST-8上,因WST-8及其生成的甲臢染料是高度水溶性的,不会进入细胞内,所以CCK-8不能对活细胞进行染色。
9) 必须设定参比波长?设定参比波长的目的是什么?
不一定,CCK-8在参比波长处没有吸光度。设定参比波长的目的是为了去除由于样品浑浊产生的吸收。
10)每次测定的数值不一样,是什么原因?如何解决?
可能存在以下几个原因:a)当在培养箱内培养时,培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发,由于体积不准确而增加误差。通常情况最外一圈孔只加培养基,不作为测定孔用;b)有可能因为CCK-8沾在壁上而产生误差,建议在加入CCK-8,轻轻敲击培养板以帮助混匀;c)每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1000~100,000个/孔范围内摸索条件。
11)如果OD值太低,可以采取什么办法?
可采取2种办法:a)适当增加细胞数量;b)延长加入CCK-8后的孵育时间。
12)如果OD值太高,但不能减少细胞数量,如何解决?
可以缩短加入CCK-8后的孵育时间。比如,可以把加入CCK-8后的孵育时间由原来的3h缩短到2h。
13)CCK-8显色过程种如何终止反应?
有以下几种方法(96孔板):a)显色反应后,将培养板置于4℃冰箱;b)每孔加10 μL0.1M的HCL溶液;c)每孔加10 μL 1% w/v SDS溶液。反应终止后请在24h内测定OD值。
14)必须预培养细胞吗?
不一定。如果需要保持细胞的最佳状态,建议预培养细胞。如果不做预培养,细胞内的脱氢酶可能会不稳定。有的科研人员不做预培养,但做标准曲线和检测时需要统一检测条件。
15)预培养后,更换培养基需要细胞计数吗?
一般情况下用胰蛋白酶处理对数增长期的细胞,用血球计数板计数,制备成一定浓度的细胞悬液即可。如果想要精密计数细胞的话,可以预培养后取培养基用血球计数板进行计数。
16)CCK-8对于不同的细胞灵敏度是否一样?
不一样。悬浮细胞相比较难染色。对于贴壁细胞,一般加入CCK-8后1-4h吸光度已经很高,但对于悬浮细胞则可能吸光度较低,可以通过延长CCK-8的染色时间或增加细胞数量来解决。
17)悬浮细胞和贴壁细胞在数量上有何区别?
悬浮细胞由于染色比较困难,一般需要增加细胞数量和延长培养时间。贴壁细胞染色比较容易,若细胞数量过大,有时吸光度会超过酶标仪的读数。
18)应该每次做标准曲线吗?
建议每次都做。虽然细胞相同,但是细胞状态不一样。对于状态不一样的细胞建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样,灵敏度可能有轻微的差异,此时也建议分别做标准曲线。
19)实验之前是否需要先检测以下培养基和CCK-8之间是否有反应?
建议使用一个孔做下检测,因有时培养基种可能含氧化还原物质。正式实验之前有必要先确认下培养基和CCK-8是否有反应。一般正常的OD值应该在0.4以下。
20)有时在药物作用下,细胞已经死亡,但脱氢酶的活性还在,是否能计算细胞数量?
不能。由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反应活细胞数量。如果细胞已经死亡,即使脱氢酶的活性还有,测定出来的细胞数量将会比真实值高,不能反应真实的活细胞数量,建议采用别的方法测定。
21)可否使用384孔板进行实验?
可以。向每孔加入培养基总体积10%的CCK-8。如果加入CCK-8体积太少,可以先将CCK-8稀释一倍,然后加入培养基总体积20%的量。
22)CCK-8与胸苷结合检测之间是否有相关性?
有。但请注意由于CCK-8使用的检测原理与胸苷检测的不同,因此,结果可能不同。
23)CCK-8能否检测细菌细胞?
可以检测大肠杆菌,但不能检测酵母细胞。向每孔100μL大肠杆菌培养液中加入10μL CCK-8,培养1-4h或过夜。
24)CCK-8的稳定性如何?
CCK-8在2-8℃能稳定保存1年,推荐用此方法检测;长期不用也可置于-20℃稳定保存2年。
规格信息
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