Stable Chemically Competent Cell 大肠杆菌化学感受态细胞

Stable Chemically Competent Cell 大肠杆菌化学感受态细胞

货号: MF2328-5000UL 品牌: Jinpan 标签: 分子生物学

描述

Stable Chemically Competent Cell 大肠杆菌化学感受态细胞

产品标签:

Stbl3;Stbl2;HB101;Stable;Direct repeats 直接重复片段;Lentiviral expression vectors 慢病毒表达载体;Gibson Assembly 一步法克隆检测试剂盒;

 

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货号 产品名称 规格 价格(元)    
MF2328-1000UL     Stable Chemically Competent Cell大肠杆菌化学感受态细胞    10×100μl       280
MF2328-5000UL Stable Chemically Competent Cell大肠杆菌化学感受态细胞 50×100μl 1280

 

产品组分:

组分编号       组分名称

货号(规格)

MF2328-1000UL  MF2328-5000UL    
MF2328-A Stable Competent Cell 10×100μl              50×100μl      
MF2328-B Control Vector puC19, 10 pg/µl       10μl 10μl

 

菌株描述

Stable菌株是NEB公司开发的高转化效率的大肠杆菌菌株,特别适合分离含重复元件和不稳定插入序列的质粒克隆,也适合分离和扩繁逆转录病毒/慢病毒载体克隆。与商业化的同源重组反应体系比如NEBuilder HiFi DNA Assembly,Gibson Assembly反应体系和酶切连接体系都兼容。Stable菌株基因型与Stbl2,Stbl3没有关联性,但具有更优异的性能(见图1)。基因组含有重组酶recA1 relA1突变,能有效抑制长末端重复序列的重组,降低了错误重组的频率。还含有核酸酶内切酶endA1突变,避免了质粒提取过程中核酸酶的污染,显著提高制备质粒的产量和质量。基因组含有lacZΔM15,适用于蓝白斑筛选。菌株本身含链霉素和四环素抗性,在成功转化后赋予其额外的筛选标志。

Stable菌株基因型:F’ proA+B+ lacIq ∆(lacZ)M15 zzf::Tn10 (TetR) ∆(ara-leu) 7697 araD139 fhuA ∆lacX74 galK16 galE15 e14-  Φ80dlacZ∆M15 recA1 relA1 endA1 nupG rpsL (StrR) rph spoT1 ∆(mrr-hsdRJP-mcrBC

菌株亮点

◇   Stable菌株具有很高的转化效率,经pUC19检测转化效率>5×108 cfu/μg DNA;

◇   Stable菌株是基因克隆进入腺病毒/慢病毒载体的推荐宿主菌;

◇   Stable菌株是克隆正向重复序列和反向重复序列的推荐宿主菌;

◇   Stable菌株含recA1突变,能减少克隆DNA的重组发生,从而降低错误重组频率;

◇   Stable菌株含mcrAΔ(mrr-hsdRJP-mcrBC),能有效转化真核来源的甲基化DNA或PCR、cDNA和许多其他来源的非甲基化DNA;

◇   Stable菌株含endA1(非特异核酸内切酶I)突变,确保得到最高质量和产量的质粒;

◇   Stable菌株含fhuA突变,具有对噬菌体T1的抗性;

◇   Stable菌株含lacZΔM15,适用于具α-互补载体的蓝白斑筛选;

 

产品描述

本品是Stable菌株经特殊工艺制作所得的感受态细胞,可用于DNA的热击转化。经pUC19质粒检测转化效率>5×108 cfu/μg DNA。且在-80℃能稳定保存几个月转化效率不发生改变。

 

保存与运输条件:

保存:-80℃保存,六个月有效。

运输:干冰运输。

 

Stable与Stbl3克隆性能(错误重组率)的比较

Stable Chemically Competent Cell 大肠杆菌化学感受态细胞

图1. Stable与Stbl3克隆不稳定DNA序列的性能比较。pUC-5xREP含5 x 32bp 重复序列,其在普通大肠杆菌中很不稳定。酶切后线性化的pUC19片段2.2ng+1ng 5xREP DNA片段配制成重组反应体系,重组反应完成后分别转化Stable感受态细胞(A)或Stbl3感受态细胞(B),复苏60min,涂布在含50μg/ml羧苄青霉素的LB平板,30℃培养20h。之后做菌落PCR,检测5xREP DNA插入的稳定性(含有正确插入片段的克隆,菌落PCR片段为623bp)。

 

注意事项

1)   对不稳定DNA克隆或逆转录病毒/慢病毒载体克隆,涂板后应在30℃培养,以减少错误重组的发生概率。

2)   制备高纯度病毒质粒,需使用新鲜转化的平板接菌,新鲜菌液提取质粒,菌液不可低温保存后使用。

3)   对不稳定的克隆或病毒质粒优先以质粒状态保存,尽量避免以转化在大肠杆菌细胞的方式保存质粒。

4)   感受态细胞必须用干冰运输。感受态细胞应在-80℃保存,不可反复冻融且放置时间过长,否则会减低感受态细胞的转化效率。

5)   最好在冰上融化感受态细胞。冰上融化时间不宜过长,长时间会降低转化效率,混入DNA需轻柔操作。

6)   进行转化操作时,需在相应温度及无菌条件下进行。

7)   为防止转化实验不成功,可保留部分连接反应液以重新转化,将损失降到最低。

8)   产品包装内含质粒pUC19 DNA(10 pg/μl),供对照实验用。

9)   为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法【所有操作均在无菌条件的标准下进行】

1)   从-80℃取出感受态细胞迅速置于冰浴中5-10min使其完全融化。

2)   向融化的感受态细胞中加入目的DNA(1-2μl含100pg-100ng质粒DNA),用手轻弹混匀(避免用移液枪上下吹打),冰浴静置30min。

3)   42℃热击45s,迅速将离心管转移到冰浴中,冰上静置5min。此过程不要摇动离心管。

4)  向每个离心管中加入900 μl无菌的SOC或LB培养基(不含抗生素),混匀后置于30℃ 摇床,250rpm振荡培养60min,目的使质粒上相关的抗性标记基因表达,使菌体复苏。

【注意】:当质粒中含不稳定片段,30℃培养能降低错误重组的概率。当转化pUC19对照,需用37℃,225rpm培养60min来复苏。】

5)   提前将筛选平板拿出置于30℃孵育使其温度保持在30℃。

6)   通过轻弹管子和倒置使得细胞完全混匀后,吸取50-100μl直接加入含相应抗生素的SOC或LB固体琼脂培养基上;或5000rpm离心1min,留取100μl左右吹打重悬菌体,吸取适量加到含相应抗生素的SOC或LB固体琼脂培养基上;之后用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开,将平板置于室温(或30℃)直至液体被吸收,倒置培养,30℃培养20-24h或37℃过夜培养。

【注意】:当质粒中含不稳定片段,30℃培养能降低错误重组的概率。当转化pUC19对照,需37℃过夜培养。

【注意】:a)涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA总量较多,可取少量转化产物涂布平板;反之,若转化的DNA总量较少,可将所有转化产物涂布平板。b)新制备的固体培养基不易涂干,可将平板正置于30℃直至液体被吸收后再倒置培养。c)涂布剩余的菌液可置于4℃保存,如果次日的转化菌落数过少,可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。

附表1 固体和液体LB培养基配方

组分Component LB(液体)/升        LB(固体)/升     
胰蛋白胨Tryptone 10g 10g
酵母提取物Yeast extract      5g 5g
氯化钠NaCl 10g 10g
1N NaOH 调整pH至7.0 调整pH至7.0
琼脂Agar / 15g

附表2 固体和液体SOC培养基配方

组分Component SOC(液体)/升      SOC(固体)/升   
胰蛋白胨Tryptone 20g 20g
酵母提取物Yeast extract     5g 5g
NaCl 0.5g 0.5g
KCl 0.186g 0.186g
MgCl2 0.95g 0.95g
MgSO4 1.2g 1.2g
Glucose 3.6g 3.6g
1N NaOH 调整pH至7.0 调整pH至7.0
琼脂Agar / 15g
1N NaOH 调整pH至7.0 调整pH至7.0
琼脂Agar / 15g

附录1. Stable感受态细胞常见问题

1.  Stable菌株的基因型和各基因赋予菌株的特征?

Stable基因型:F’ proA+B+ lacIq ∆(lacZ)M15 zzf::Tn10 (TetR) ∆(ara-leu) 7697 araD139 fhuA ∆lacX74 galK16 galE15 e14-  Φ80dlacZ∆M15 recA1 relA1 endA1 nupG rpsL (StrR) rph spoT1 ∆(mrr-hsdRJP-mcrBC

◇  蓝白斑筛选(Φ80 Δ(lacZ)M15):使得β-gal omega片段。lacX74去除染色体上的β-gal基因。pUC19和相似基因编码β-半乳糖苷酶(lacZ)的α肽。α肽与β-半乳糖苷酶的omega片段(由F’携带,α-互补)结合。当β-半乳糖苷酶按照这种方式重新组合后能正常表达并切割X-gal生成蓝斑。当克隆DNA进入质粒破坏α肽基因,使得菌落为白斑。

◇  重组缺陷(recA1):大肠杆菌(E. coli)本身具修复系统能重组同源序列。基因组克隆通常有复制区,recA介导的重新排列不确定,特别当同源序列长于50bp。recA功能缺失的菌株比recA+菌株通常更缓慢生长。

◇  内切酶I缺陷(endA1):野生型大肠杆菌的周质空间含非特异性内切酶。从这些菌株中制备质粒特别要注意质粒被降解。endA突变去除这个基因,显著改善了质粒制备物的质粒。

◇  限制缺陷(Δ(mrr-hsdRJP-mcrBC)):野生型大肠杆菌K12菌株含限制性内切酶,能切割含位点(AAC(N6)GTGC和GCAC(N6)GTT的DNA。虽然大肠杆菌DNA自身受保护,不被同源甲基转移酶所降解,但外源DNA会在这些位点被切割。限制缺陷删减了甲基转移酶和内切酶的基因。

◇  甲基限制缺陷(mcrA Δ(mrr-hsdRJP-mcrBC)):大肠杆菌具有一套酶系统,mcrA,mcrB和mrr能够切割在高等真核生物和某些植物、细菌菌株发现的甲基化DNA。来自PCR扩增片段,cDNA或原先在大肠杆菌内扩繁的DNA不会被甲基化,也不会被切割。

◇  T1噬菌体抗性(fhuA):T1,一种极端烈性噬菌体需要大肠杆菌羟肟酸铁吸收受体用来感染。这个基因的删减赋予对这个噬菌体的抗性,且不会显著影响转化或细胞的生长特征。

2.  Stable感受态细胞能替换Stbl2或Stbl3吗

答复:是的,Stable建议用于所有难克隆实验。Stable菌株的基因型与Stbl2或Stbl3没有关联性,但性能更优越。通过分别克隆DNA片段(含5 x 32bp 重复序列)到三个菌株来比较性能。

通过NEB Gibson Assembly 技术构建的重组质粒pUC-5xREP,然后将构建的重组质粒反应体系分别转化进入三种感受态细胞,之后用克隆PCR来分析5xREP插入序列稳定性。

~30℃,24h,Stbl2克隆生长到1mm直径,在测定的所有插入质粒的克隆中都发现缺失(33个克隆,33个都有缺失);

30℃,18-20h,Stbl3克隆生长到1mm直径,在测定的所有插入质粒的克隆中67%有完整的5xREP插入序列(33个克隆,22个正确);

Stable在30℃生长很好,30℃,18-20h,Stable克隆生长到1mm直径,5xREP插入序列稳定性是做好的。在测定的所有插入质粒的克隆中97%有完整的5xREP插入序列(33个克隆,32个正确);

更重要的是,Stable含endA突变(与Stbl3不同),提取质粒中无核酸内切酶I污染。

3. Stable感受态细胞适合大质粒转化?

答复:是的,根据NEB官方(Stable菌株开发商)数据,Stable成功转化24kb质粒。与pUC19(2.7kb)比较,当等量DNA分子转化进入细胞,24kb质粒的转化效率约为pUC19的80%。

 

 

 

规格信息

品牌:

Jinpan

CAS:

N/A

规格:

50×100μl

货期:

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