细胞增殖-毒性检测试剂盒CCK-8(CCK8)

Cell Counting Kit-8

商品信息

更高灵敏度检测方法CCK-L（点击查看）

产品用途	点击查看产品详情	产品优势
细胞凋亡检测	Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit （手机端点击）	灵敏度高 象限区分好 性价比高
	Annexin V, 633 Apoptosis Detection Kit （手机端点击）
	Caspase-3 Assay Kit -Colorimetric- （手机端点击）
细胞毒性检测 （检测死细胞数量）	Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST （手机端点击）	与CCK-8双重验证细胞毒性 CAR-T&ADCC实验可用
活死细胞双染	Calcein-AM/PI细胞双染试剂盒 （手机端点击）	荧光结果与CCK-8双重验证 高分文献支持 操作简便
细胞内亚铁离子 检测	FerroOrange （手机端点击）	更多铁死亡检测方法 点击查看

Cell Counting Kit-8是用于化学药物等对细胞增殖或毒性实验时进行细胞计数的试剂盒。试剂盒中使用高灵敏度的新型水溶性四唑盐WST-8甲臜染料作为显色底物，与传统的细胞计数试剂盒相比，灵敏度大幅度的提高。WST-8被细胞内的脱氢酶还原产生水溶性的甲臜染料。通过直接测量甲臜染料（450 nm）的吸光度，即可测出活细胞的数量。细胞数量与甲臜染料成正比关系。同时试剂盒为配置好的1瓶溶液，易于使用。

1）对比[³H]法，无需放射性同位素。

2）使用水溶性四唑盐与水溶性甲臜染料，因此无需DMSO换液操作步骤。（如MTT分析等需要）

3）与其他水溶性四唑盐法（XTT，MTS）相比，灵敏度更高的同时毒性更低。

4）试剂盒为1瓶装，无需提前配置，无需准备其他试剂。

5）试剂盒稳定性高。

6）试剂可以与酚红同时使用。

Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 包含了Dojindo开发的水溶性四唑盐—WST^®-8和电子载体(1-Methoxy PMS)。由于WST^®-8具有高水溶性，它存在于细胞外而不渗透活细胞膜，通过1-Methoxy PMS接受乳酸脱氢酶的辅酶NADH的电子而被还原，生成水溶性WST^®-8甲臜染料（最大吸收波长450nm：详见下方吸收光谱）。

Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 利用了Dojindo开发的水溶性四唑盐—WST^®-8 (2- (2-甲氧基-4-硝苯基) -3- (4-硝苯 基) -5- (2,4-二磺基苯) -2H-四唑单钠盐)，它在电子载体1-Methoxy PMS存在的情况下能够被还原成水溶性的橙黄色甲臜。 CCK-8溶液可以直接加入到细胞样品中，无需配制。CCK-8法是用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目的 一种高灵敏度，无放射性的比色检测法。WST^®-8被细胞内脱氢酶氧化还原后生成的橙黄色甲臜能够溶解在培养基中 ，生成的甲臜物的数量与活细胞数量成正比。

 

本试剂盒测定方法简单，只需一瓶试剂即可操作，无需二次配制工作液，从而提高实验者的效率。

细胞增殖实验(左)与细胞毒性实验(右)

Cell Counting Kit-8 与Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST同时检测细胞毒性

检测药物： Mitomycin C

细胞: HeLa

培养基: MEM, 10% FBS

孵育条件: 37℃, 5% CO₂, 48小时

检测波长: Cell Counting Kit-8 (450 nm), Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST^® (490 nm)

使用Mitomycin C 检测检测HeLa细胞毒性。通过使用Cell Counting Kit-8和Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST^® [货号: CK12]两种方法检测。Cell Counting Kit-8以细胞活性为指标，Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST以游离的LDH为指标，实验证实两种指标检测存在差异性。二者联用，能更全面的表征细胞毒性。

WST®-8甲臜染料吸光度与续细胞数量的关系

培养基: MEM, 10%FBS(HeLa ) , RPM1640(HL60)

孵育条件:37℃, 5%CO₂, 2hr (HeLa、HL60)

检测试剂:Cell Counting Kit-8

(●) 450 nm, XTT (◆) 450 nm, MTS

(▲) 490 nm, MTT(■) 570 nm

将HeLa细胞和HL60细胞以不同的细胞数接种到96孔板中，按孵育条件处理后加入以上每种试剂测定吸光度。根据细胞数量增加吸光度。CCK-8灵敏度、线性范围优于以上其他方法。

Cell Counting Kit-8可冷藏保存1年以上，避免试剂浪费！

试剂本身对细胞毒性的比较

HeLa细胞在96孔板中孵育(5000个/孔)。在CO2培养箱中开始显色反应，每隔3、6、24小时在显微镜下观察细胞形态。Cell Counting Kit-8在24小时后细胞形态没有改变。在使用药物进行细胞毒性试验时，应选择测量试剂本身对细胞毒性影响更小的试剂。

3D培养检测细胞毒性指南，

详见OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4 Test No. 492

Q1：96孔板操作实例外，24孔板，12孔板如何检测？

A1：与培养基1:10的比例加入。

Q2：如何测定空白孔？

A2：空白读值的来源有两部分，还原性物质与细胞本身活性。请确认以下细节。 ·还原性物质：可在正式实验之前，在培养基中加入CCK-8和待测药物。如果变色，证明药物有还原性。正式实验检测时，请在加入CCK-8前更换培养基。 ·细胞活性变化：CCK-8检测细胞活性，因此细胞活性变化，即使细胞数量不变，空白也会变化。因此需要确认细胞活性是否存在变化。

Q3：如何终止反应？

A3：有一下几种方法（96孔板）： 1、 在显色反应后，将培养板放置4℃冰箱内。 2、 每孔加10 μl 0.1 M HCL溶液。 3、 每孔加10 μl 1%（w/v）的SDS（十二烷基硫酸钠）溶液。 注意：反应停止后，应在24小时之内测定。 4、使用本公司Stop Solution for CCK-8(货号:CK13).

Q4：我可以使用450 nm以外的滤光片吗？

A4：可使用430-490nm的滤光片，450nm滤光片最优。WST-8甲臜染料吸收光谱：

Q5：CCK-8运输与保存条件？

A5：试剂在4℃下可稳定保存24个月。如需长期存放可保存-20℃，但不要反复冻融。如更换其他容器，请先进行稳定性实验，确认试剂稳定性。

Q6：一个孔中应接种多少个细胞？

A6：当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔 (100 μl 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 μl 培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。

Q7：能否用384孔板进行试验？

A7：可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液，如果加入的CCK-8体积太少，可以先将CCK-8溶液稀释1倍，然后加入培养基体积20%的量

Q8：能否用24孔板进行试验？

A8：可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液。

Q9：酚红会影响检测吗？

A9：不会。培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。

Q10：CCK-8与胸苷结合检测之间是否有相关性？

A10：有。然而，请注意由于CCK-8使用的检测原理与胸苷检测的不同，因此结果可能不同。

Q11：CCK-8能否检测细菌细胞？

A11：可以检测E.coli，但不能检测酵母细胞。向100 μl E.coli培养液中加入10 μl CCK-8溶液，并培养1-4个小时或过夜。但是更推荐使用我公司货号M439的：细菌活性检测试剂盒。

Q12：如何减少由于CCK-8试剂在枪头上或孔壁上的残留所带来的误差？

A12：可以在加样前用培养基稀释CCK-8试剂并混匀后加样。

Q13：CCK-8是什么颜色？

A13：应该是粉红色。若颜色不一样，有可能会影响测定。

Q14：CCK-8能否对活细胞进行染色？

A14：不能。因为CCK-8的主要成分是一种水溶性的四唑盐 (WST®-8)，并通过电子载体1-Methoxy PMS将活细胞中的电子交换到培养基中的WST®-8上。由于生成的甲臜也是高度水溶性的，因此CCK-8不能对细胞进行染色。

Q15：CCK-8检测溶液对细胞是否有毒？

A15：CCK-8溶液自身因为高浓度的1-Methoxy PMS的存在而具有一点毒性。但是，加到培养基中的CCK-8是没有毒性的，因为被稀释了10倍。因此，长时间的培养，如过夜或者培养数天是可以的。同一个细胞培养液在CCK-8检测后还可以用于其他细胞增殖检测，如结晶紫检测，中性红检测或者DNA荧光检测等。由于每种细胞对于CCK-8的耐受力都不同，因此在需要进行长时间培养时，先检测一下细胞在加入CCK-8培养后的活力。

Q16：在做加药实验时，药物对测定是否有影响？如何解决？

A16：有时会有影响。如果药物具有还原性，会和CCK-8发生显色反应，增加吸光度。解决办法：首先要确认药物是否有吸收，在含有药物的培养基中加入CCK-8，测定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含药物的培养基 (加CCK-8)的吸光度高，则证明药物有影响，可在加CCK-8之前更换培养基，去掉药物的影响。

Q17：每次测定的数值不一样，是什么原因？如何解决？

A17：可能会有以下几个原因： 1. 当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。 一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。 2. 有可能会因为CCK8沾在壁上而产生误差，建议在加入CCK-8后，轻轻敲击培养板以帮助混匀。 3. 每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1,000-100,000个/孔范围内摸索条件。

Q18：如何设定空白对照？

A18：在不含细胞的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时，还应考虑药物的吸收，可在不含细胞，加入药物的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度作为空白对照。

Q19：哪些物质会影响CCK-8的测定？

A19：当有还原性物质存在时会影响CCK-8的测定，例如含有维生素C的Glucose等 (一般培养基中的量不多，酚红或血清不影响测定)。在有酚红存在的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白吸收即可。

Q20：在实验中吸光度值太高，如果不能减少细胞数量，如何解决？

A20：可以缩短加入CCK-8后的培养时间。例如：可以把加入CCK-8试剂后的培养时间由2小时缩短为1小时。

Q21：设定参比波长的目的是什么？必须设定吗？

A21：不一定要设定。CCK-8试剂在参比波长没有吸光度。设定参比波长的目的是为了取出由于样品混浊所带来的吸收。

Q22：说明书上仅写了96孔板的测定方法，如果使用24孔板货12孔板，应该加多少量的CCK-8试剂？

A22：一般情况下建议加入CCK-8试剂的量是培养基体积的1/10。

Q23：必须预培养细胞吗？

A23：不一定。如果要向保持细胞的最好状态，建议预培养细胞。如果不做细胞预培养，细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有人不做细胞预培养，但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。

Q24：如果加入的药物中含有金属，是否会有影响？

A24：金属对CCK-8显色有影响。当终浓度为1 Mm的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是10 Mm的话，将会100%抑制。

Q25：预培养后，更换培养基需要细胞计数吗？

A25：一般情况下用胰蛋白酶处理对数增长期的细胞，用血球计数盘计数，制备成一定浓度的细胞悬液即可。如果想要精密计数细胞的话，可以预培养后取培养基用血球计数盘进行计数。

Q26：CCK-8对于不同的细胞，灵敏度是否一样？

A26：不一样，悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对于贴壁细胞，一般加入CCK-8培养1-4小时吸光度已经很高，但对于悬浮细胞则可能吸光度较低，可以通过延长CCK-8的加入时间或增加细胞数量来解决。

Q27：悬浮细胞和贴壁细胞在数量上有何区别？

A27：悬浮细胞由于显色比较困难，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。贴壁细胞显色比较容易，若细胞数量过大，有时吸光度会超过酶标仪的读数。

Q28：应该每次做标准曲线吗？

A28：建议每次做。虽然细胞是一样的，但是细胞的状态不一定一样，对于状态不一样的细胞，建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样，灵敏度可能会有轻微的差异，对于不同的批号建议分别做标准曲线。

Q29：有时在药物作用情况下，细胞已经死亡，但是脱氢酶的活性还在，是否能计算细胞数量？

A29：不能。由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞数量

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