GenomONE ^® –CF EX

GenomONE ^® 仙台病毒包膜细胞融合试剂

　　GenomONE^®–CF EX 含有仙台病毒包膜和专用缓冲液，可促使细胞融合。

适用于贴壁/悬浮状态的所有细胞，仅需 30 min，即可制备融合细胞和杂交瘤。

◆用途

●　制备杂交瘤

●　应用于癌细胞与树状细胞融合的癌症免疫研究

●　应用于内脏来源细胞与干细胞融合的再生医疗研究

●　应用于去核未受精卵的核移植等的发育、繁殖和育种研究

●　替代电融合法、PEG 法

◆HVJ Envelope（HVJ-E）：

　　HVJ 包膜（HVJ-E）是完全灭活和纯化仙台病毒（HVJ*），即只留下细胞膜融合能力的衣壳蛋白包膜。仙台病毒的HN蛋白可与细胞膜外的唾液酸受体结合，通过Ｆ蛋白的作用，引起细胞膜融合。在 HVJ-E 中，仙台病毒的基因组 RNA 已经完全失活，在人类和实验动物体内不存在感染或增殖。因而不需要特殊的操作和设备，它可以安全地在普通的实验室使用。

*HVJ：日本仙台病毒

◆HVJ-E 细胞融合原理

在低温（0 – 8℃)条件下，每一个细胞与数百个以上的 HVJ – E 接触，HVJ – E 与细胞膜上的唾液酸受体结合，通过细胞表面吸附（步骤１），细胞通过 HVJ-E 相互连接（步骤２），形成细胞彼此聚集的状态。当该细胞/HVJ-E 的复合物加热到 37℃ 时，细胞膜干扰就会进一步扩大，细胞膜内膜结构也暂时改变。这种变化是短暂的，随后会立即返回到正常结构，但是在这个期间，细胞膜利用强疏水性结合力进行相互融合（步骤３）。

步骤一	步骤二	步骤三

◆应用方法

悬浮法	电融合法

◆悬浮细胞融合案例

同种细胞融合

异种细胞融合

　　荧光标记的红（* 1）细胞和绿色荧光标记（* 2）细胞（每1.0×10⁵个）在融合缓冲液 50 μL 混合后，加入 HVJ-E 冰敷５分钟，随后 37℃ 下反应 15 分钟后，融合细胞（黄色）进行了观察。

◆黏着态和悬浮态细胞融合案例

在粘合状态BHK-21（红）和在浮动状态（绿色）的P19细胞的融合

胶粘状态的HeLa S3（红）在浮动状态（绿色）的P19细胞的融合

　　荧光标记的（* 1）中的红，附着的细胞在 12 孔平板，绿色荧光标记（* 2）中，添加预先准备的 HVJ-E，来处理漂浮细胞１×10⁵个的悬浮液（融合缓冲污染），并在室温下离心（1000转），每个板５分钟。随后孵育37℃15分钟后，更换增殖用的培养基继续细胞培养。观察３个小时后的融合细胞（黄色）。

◆和 PEG 法的比较

　　红色荧光标志(* 1）的 ratMSC（骨髓由来老鼠间叶系细胞）和绿色荧光标识的老鼠原代培养心肌细胞２×10⁵个融合缓冲液 50 μL 中混合后，添加 HVJ – E，冰浴５分钟，然后 37℃ 孵育反应15分钟，观察融合细胞（黄色）。１-２日培养后，观察到粘着的融合细胞。在 PEG 法中融合紧接之后细胞毒性强烈，融合细胞的数量很少。

◆安全性说明

HVJ-E 失活的确认（确认无感染性病毒的存在）

1.	细胞增值实验（荧光灶单元（FFU）法） 处理 LLC-MK2 细胞，一到两天后，病毒生长性的 HVJ 融合蛋白F抗体通过荧光抗体法测定，已证实未检测到病毒蛋白。<制造阶段实验>
2.	受精卵生长试验（血凝单位测定） 处理受精卵，３天后的病毒增殖，包括在 HVJ 表面的 HN 蛋白的红血细胞聚合活性（HAU）测量作为指标，已经证实，没有看到病毒的生长。<制造阶段实验>
3.	小鼠感染性研究 鼻腔给药小鼠和未处理小鼠（SIX周）在相同笼中饲养，通过测定血清中的抗 HVJ 抗体滴度进行了个体之间感染性的检测。其结果是，在非给药的情况下未观察到抗体滴度增加，表明未感染 HVJ-E。
4.	动物个体的遗传基因导入实验 小鼠、大鼠等实验动物的各种药物实验（肺、气管、肝和静脉等）。已证实完全没有病毒感染或是可疑的事例。

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Q&A

Q1：什么是GenomONE^®–CF EX？
A1：GenomONE^®–CF EX 是由 HVJ 包膜（HVJ-E）和特殊缓冲液组成的细胞融合试剂盒。 它可以用于贴壁细胞和悬浮细胞。 使用该试剂盒

A1：融合相同或不同类型的细胞只需30分钟。

Q2：HVJ-E的特性？
A2：HVJ包膜是通过完全灭活的仙台病毒（HVJ：日本血凝素病毒）纯化后的产物。 它是一种囊泡，其中仅保留仙台病毒具有细胞膜融合能力

        的包膜蛋白。 众所周知，在鞘膜外耳炎（包膜）仙台病毒中的HN蛋白能识别细胞膜上的受体（在糖链的末端具有唾液酸）并且将其吸收，

        从而通过F蛋白（包膜的另一组分）介导膜融合。 HVJ-E中包含的仙台病毒基因组RNA已经完全灭活，并且在人或实验动物中既不能感染

        也没有增殖潜力。HVJ-E可以在普通实验室中安全使用，无需任何特殊操作或设施。

Q3：失效日期？
A3：在铝纸包装上印刷了冻干的 HVJ-E 的保质期。

Q4：对于 HVJ 灭活方法？
A4：虽然HVJ-E使用HVJ（仙台病毒/鼠副流感病毒1）作为原料，但HVJ的基因组RNA已经通过药物治疗而完全灭活*。 HVJ-E不会在人或动物

        中增殖或表现出致病作用。

A4：参考文献：Prior, P. et al.: BioPharm, 22-33 (Oct. 1996) Kaneda, Y. et al.: Advances in Genetics, 53, 308-332 (2005).

Q5：病毒灭活的评估和确认？
A5：通过对培养的细胞和生长的鸡蛋进行病毒增殖性电位排除试验，证实了每批的 HVJ 已经失活。

Q6：确认病毒灭活的方法？
A6：通过以下三种方法证实了在人或实验动物中缺乏HVJ-E的感染或增殖的可能性。
A6：（1）使用培养细胞的测定
A6：（2）使用受精的鸡蛋进行测定
A6：（3）使用小鼠进行测定

Q7：实验室生物实验安全级别，使用注意事项？
A7：GenomONE^® 可以在普通实验室安全使用。虽然 HVJ-E 使用 HVJ（仙台病毒/鼠副流感病毒1）作为原料，但HVJ的基因组RNA已经通过

        药物治疗而完全灭活。 HVJ-E不会在人或动物中增殖或表现出致病作用。

        然而，当使用该产品进行细胞融合实验时，产生的重组生物体等可能属于卡塔赫纳生物安全议定书的限制。

        使用本产品生产重组生物体的实验者必须采取适当措施，防止此类生物体扩散，然后再使用本产品进行实验。
        此外， DNA 重组实验，必须遵循重组 DNA 实验规则（在使用国的相关法规中规定或由相关设施的安全委员会规定），并且实验只能在具

        有合适设施的实验室中进行 DNA 重组实验。

Q8：质量保证？
A8：
A8：◆　通过对培养细胞和受精鸡蛋的病毒增殖性电位排除试验，确认每批 HVJ 的灭活。
A8：◆　无菌检测证实了不存在细菌和真菌污染。
A8：◆　内毒素水平已被证实小于 2.5 EU / mL（鲎细胞裂解物凝胶凝块测定）。

Q9：许可证要求和商业用途？
A9：本产品由一个或多个专利的权利要求所覆盖，并且仅授予研究用途。 未经制造商事先书面许可，不得用于任

A9：何商业或其他目的，或在修改后转售等（Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd.）。

Q10：每种试剂的作用？
A10：
A10：◆　冻干的 HVJ-E：HVJ-E 是通过完全灭活 HVJ（仙台病毒）制备的纯化囊泡，其中仅保留 HVJ 具有细胞膜融合能力的包膜蛋白。

A10：◆　HVJ-E悬浮缓冲液：用于复融，重悬，稀释 HVJ-E 或其他目的的生理浓度的中性缓冲液。
A10：◆　细胞融合缓冲液：用于细胞融合的优化缓冲液。
A10：◆ “细胞融合缓冲液（20X浓缩物）”应在使用前用无菌纯水（例如，不含内毒素的注射用水）以1：20 稀释。

Q11：每种试剂的成分和浓度？
A11：无相关数据。

Q12：重组 HVJ-E 悬浮液的储存？
A12：
A12：◆　为了连续使用，请在冰箱（２-８°C）存放最多两个星期。
A12：◆　对于长期储存，根据每次使用量将试剂分装保存在 -80℃ 下冷冻最多３个月。 冷冻后只能解冻一次。

Q13：“HVJ-E 悬浮缓冲液”和“细胞融合缓冲液（20X）”的保存？
A13：储存在冰箱（２-８°C）。 不要冻结。

Q14：HVJ-E 的粒度？
A14：约 300 nm（200-400 nm）

Q15：HVJ-E 颗粒数？
A15：40 mL 复融的 HVJ-E 悬浮液包括约 109-1010 个 HVJ-E 颗粒。

Q16：HVJ-E 的血细胞凝集单位（HAU）？
A16：40 mL 复融的 HVJ-E 悬浮液，相当于约 1,000-2,000个血凝单位（HAU）。

Q17：使用频率？
A17：
A17：◆　对于相同或不同类型的细胞的融合：约 100 次
A17：◆　用于制备Ｂ细胞杂交瘤：约 10 次

参考文献

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