核酸杂交即提供条件使探针能特异性地与尼龙膜上的互补核酸序列退火杂交。

在印迹之后，膜可能会用包含封闭液的预杂交溶液进行孵育，使探针与膜的非特异性结合最小化，然后膜将与杂交缓冲液中的探针进行孵育，在杂交缓冲液中，探针会与和它互补的核酸靶点进行杂交。这些步骤通常会在一个控制温度的杂交烘箱或摇床上旋转的试管中进行，并且经常过夜。

影响杂交严格度的因素很多：在杂交过程及之后从膜上去除未结合探针的清洗过程中，均可通过调整温度和盐浓度来控制严格度。

对于短探针，计算探针熔解温度（也称为Tm）用于估计杂交温度。在某些情况下，使用较低严格度的条件是有利的，比如检测低同源序列（如假基因），检测之后，可以从膜上去除探针，使它能够用其他的探针的分析。

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