反相层析（RPC）根据疏水性分离蛋白和多肽。RPC对蛋白、多肽和核酸的高分辨率分离变得日益重要。

此方法需要使用有机溶剂，当不关注活性和三级结构时广泛用于样品纯度的分析检验。由于许多蛋白在有机溶剂中变性，因此不推荐使用RPC进行蛋白的制备纯化。

在进行RPC过程中，蛋白易于变性，并与填料之间紧密结合。通常需要使用有机溶剂进行洗脱。经常使用的有乙腈，甲醇，乙醇和异丙醇。RPC多用于耐受有机溶剂的蛋白纯化的最后一步。